中国食品微生物能力验证霉菌酵母菌计数 【检验方法比较】

2022-12-30 18:25:52  点击量:

    霉菌酵母菌在自然界中分布极广，种类繁多，食品中易受到不同程度的污染。食品中霉菌酵母菌的增殖一般会导致营养价值下降、酸败变味或外观恶化等，影响货架期及口感，若霉菌、酵母菌含量较高，且日摄入量较多，会影响人体肠胃内的微生物平衡，甚至造成肠胃不适，可能引起疾病发生。霉菌对干食品的最大风险主要是在适宜的条件下(产毒株、数量、温度、湿度、水分活度等），能产生霉菌的有毒代谢产物—霉菌毒素，引起过敏反应等各种急、慢性中毒及可能的致癌作用。因此，人们愈来愈重视食品中霉菌及酵母菌污染对人体造成的危害。

    在我国国家部分食品产品及卫生标准中，把霉菌和酵母菌作为常见指示菌进行监测和控制，如饮料、坚果制品、米面制品、糕点类等食品。霉菌和酵母的检测被列入国标4789 系列食品安全微生物常规检测项目之一 , 霉菌酵母菌的检验方法看似简单，但由于食品种类繁多成分复杂，食品中存在的霉菌种类较多，对环境温湿度及营养成分的要求有所不同，要在同等条件下把所有的霉菌培养出来，反映出样品的真实情况，实属不易，且霉菌前期生长速度缓慢，后期菌丝急剧增加，特别是毛霉的蔓延，给霉菌和酵母菌的同时计数带来一定的困难，如何能更准确、快速提离食品中霉菌检测数目是食品卫生部门面临的一个严峻问题。

    能力验证是利用实验室间的比对判定实验室的特定校准、检测能力，以考察实验室检验能力的外部质量活动,组织方提供试验的样本，一般会考虑增加检测难度。为了更准确更全面得出能力验证结果，本实验室综合了多种方法进行同步检测，主要是考虑霉菌、酵母菌总数检测是通过平板中生长的菌落数目直接计数推算，培养基的质量和培养方式直接影响了检测的结果，因此，选择两种常用的霉菌酵母培养基，采用正置和倒置培养法进行试验，比较分析不同培养基、不同培养方式对霉菌酵母菌计算结果的差异，进而得出较为准确的试验结果进行上报。

2 材料与方法

2.1 样品

能力验证样品：中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供，样品编号为15-G068。

2.2 培养基及试剂

孟加拉红琼脂（广东环凯微生物科技有限公司）、马铃薯－葡萄糖－琼脂培养基琼脂（广东环凯微生物科技有限公司）、0.85%无菌生理盐水（自制）。

2.3 试验仪器

SHP-250 生化培养箱（广东环凯微生物科技有限公司）、高压灭菌锅（厦门致微生物科技有限公司)、生物安全柜(Heal ForceSafe 1200TE)。

2.4 试验方法 

2.4.1 样品处理

按照作业指导书，样品总计用40ml稀释液 ，开启后先用4ml稀释液水化样品，溶解后吸出无菌瓶中，再反复用剩余的稀释液冲洗西林瓶内壁，回收清洗液。此溶液即为待测样品原液，再按无菌操作稀释至10^-5。

2.4.2 孟加拉红培养基倾注法

样品稀释后，选择合适稀释度，取lmL置无菌平皿中，然后倾注1 5~ 20 mL孟加拉红培养基，待琼脂凝固后，分别使用正置和倒置方式于培养箱内28℃±1℃培养5天, 每个稀释度进行三次平行重复。

2.4.3 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基倾注法

样品稀释后，选择合适稀释度，取lmL置无菌平皿中，然后倾注15~20mL马铃薯 －葡萄糖-琼脂培养基，待琼脂凝固后，分别使用正置和倒置方式于培养箱内28℃±1℃培养5天,每个稀释度进行三次平行重复。

3 结果

3.1 霉菌生长计数

选择孟加拉红培养基和马铃薯－葡萄糖-琼脂培养基，分别采用正置和倒置两种培养方式进行霉菌的培养，结果如表1所示。在孟加拉红培养基中，正向放置培养方式霉菌数量比倒置培养方式高10.3%(RSD=6.96%)；在马铃薯－葡萄糖-琼脂培养基中，正向放置培养方式霉菌数量比倒置培养方式高7.1%（RSD=4.88%)。 在正向放置培养方式中，孟加拉红培养基中霉菌数量比马铃薯－葡萄糖-琼脂培养基高6.7%（RSD=4.56%); 在倒置培养方式中，孟加拉红培养基中霉菌数量比马铃薯－葡萄糖-琼脂培养基高3.6%（RSD =2.48%)。

表 1 不同培养基、不同培养方式君菌的计数情况

3.2 酵母菌生长计数

由于酵母菌和霉菌同属于真菌，生长温度和需要的营养条件一致，因此，与霉菌同时进行检测，采用同一培养基及培养方式，培养相同的时间进行计数，结果如表2所示。结果表明在孟加拉红培养基中，正向放置培养方式酵母菌数量比倒置培养方式高20.0%（RSD=12.86%）；在马铃薯－葡萄糖-琼脂培养基中，正向放置培养方式酵母菌数量比倒置培养方式高12.5%（RSD=8.32%)。两种培养基中，无论是正向培养还是倒置培养方式，酵母菌总数含量大致相同。 

表2 不同培养基、不同培养方式酵母菌的计数情况

4、讨论总之霉菌酵母菌的计数结果表明，两种培养基的培养结果总体无明显差异，孟加拉红培养基霉菌生长率略高于马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基，这也是由于培养基的成分有所不同所致，培养基中葡萄糖的含量会影响霉菌的检出率.正置培养霉菌酵母茵数量均高于倒置培养数量，霉菌培养中正置，有助于培养过程中的观察，同时也避免了霉菌孢子脱落到培养基其他部位而引起最后计数不准确；此外，正置培养方式，培养基表面的水分增多能更好的提供霉菌酵母菌生长所需要的湿度，检出数值略高。本实验在培养至第3天时，平板上已经生长了较小的霉菌菌落，第4天时，即生长了清晰的白色的酵母菌落，在培养至第5天时，霉菌的菌丝已经开始罢盖茎延到整个平板，因此，选择了在培养至第4天时，进行计数。

实验结果表明：在进行霉菌、酵母菌的能力验证实验时，主要考虑采用质量合格的培养基及正确培养方式，主要应注意以下几个方面：

1) 样品要稀释到足够的倍数，因为霉菌酵母菌在一起计数，霉菌菌落较大，要求同一个平板上菌落数不能过多，否则，难以计数。

2）采用质量合格的孟加拉红琼脂和马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基，均可给出合格的结果。

3）建议采用正置培养方式，有利于观察和中途计数，提高检出率。

4）培养条件控制。 应提供霉菌酵母菌生长的最优条件，温度为28度，保证环境湿度在60%以上。

5）应选择较早时间进行观察计数，最好在48小时后就开始观察 ，霉菌的过量生长，大量的菌丝会使菌落互相交错，即影响了霉菌的计数，也将酵母菌覆盖，从而造成不能准确计数。

6）霉菌、酵母茵应分开计数，样品中的霉菌酵母菌的数量一般不在一个数量级范围，应在不同稀释度的平板上分开计数， 同时应注意霉茵和酵母菌的形态区别，必要时采用镜检方法区分霉菌酵母菌。